麗寶醫事檢驗所

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定序技術原理

傳統定序技術以桑格定序法為代表,是桑格博士在1970 年代發明的,先以核酸擴增方法增加目標序列的量,再對核酸的序列進行偵測達到定序的效果。由於這個方法一次只可針對一條基因序列,定序時間也會受目標序列的長短影響,雖然定序結果可靠,但產量低及成本高。由於使用傳統定序技術定序人類基因體過於昂貴,因此發展出第二代定序技術,也就是次世代定序技術。次世代定序技術的實驗流程大致分為5 個步驟,分別是檢體採集與保存、樣本庫製備、基因序列的定序反應與基因序列讀取、基因序列比對分析及產出檢測報告。檢體採集與保存大致與第一代定序技術所使用的相同,但次世代定序技術跟第一代最大的不同點在於樣本庫製備。第一代定序與次世代定序都需要擴增基因序列,然而第一代定序直接對擴增的基因序列進行定序,而次世代定序是把每條擴增後的基因序列打成數百萬個小片段,再同時對數百萬個小片段定序,因此可快速完成基因組定序,且錯誤率低於傳統定序,每個鹼基的定序價格也較低。序列讀取完畢後,與資料庫比對分析,確認是否有基因變異。


螢光 PCR法(qPCR)

Q-PCR技術利用專一的Primer probe(引子探針)會在PCR(聚合酶連鎖反應)過程中 產生螢光,再利用螢光偵測系統來偵測每個循環(cycle)所釋放出的螢光量,進而推算出每個循環所產生的產物含量,達到即時定量的目的。利用螢光物質 與DNA片段結合的特性,來達到偵測的目的,隨著反應進行,螢光強度也將隨之增加,觀察螢光的強度,即可得到欲偵測物的起始濃度差異,依據此原理 可進行多種實驗應用。 




次世代定序技術臨床應用


次世代定序法因能同時對數千到數百萬個DNA 分子定序,以大量的小片段搭配電腦運算達到定序的結果,因此這項技術可廣泛運用到個人醫學、遺傳疾病、臨床診斷等領域。常見的有全基因體定序、外顯子定序、新基因定序、轉錄體定序進行mRNA、miRNA 表現量分析及RNA 定序研究等。適用的臨床檢體包含冷凍組織、血液、尿液或石蠟包埋組織,到動物、植物,以至於細菌檢體,只要能萃取出足夠的DNA 量,都適用於次世代定序法。

(內容節錄自:科技部 科學發展月刊2020年11月575期 次世代定序技術)